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如何進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)?

發(fā)布時(shí)間: 2023-08-29  點(diǎn)擊次數(shù): 1232次

1. 配制培養(yǎng)基: DMEM=內(nèi)酮酸鈉++10%血清++青鏈毒素

2. 復(fù)蘇37度融化后,擦干凍存管酒精擦,細(xì)胞加入15m離心管,加5ml培養(yǎng)基500g離心5min,棄上清,加1ml 培養(yǎng)基重懸后加入到培養(yǎng)瓶中,5~6ml左右,記得晃勻。

3. 傳代:吸出舊培基,加5mIPBS洗一遍,用移液管加1ml胰酶,洗一遍吸出,37度放1min左右計(jì)時(shí)看到大片大片脫落了即加入新培基吹打,吹洗充分后,吸1ml加到事先加好10ml 新培育基的新瓶里。

293T細(xì)胞是用5型腺病毒75株系轉(zhuǎn)化,含有Ad5E1區(qū)的人胚腎亞三倍體細(xì)胞系,是一種E1區(qū)缺陷互補(bǔ)細(xì)胞系。293T 細(xì)胞是貼壁依賴(lài)型呈上皮樣細(xì)胞,表現(xiàn)出典型的腺病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞的表型細(xì)胞允許Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖

哺乳細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)方式有三種:貼壁培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、無(wú)血清懸浮培養(yǎng)這三種方式均可用于293T 細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。293T細(xì)胞在無(wú)Ca2+或含Ca2+培養(yǎng)基中可同樣生

長(zhǎng),也可生長(zhǎng)在血清濃度降低的培養(yǎng)基中。

單層培養(yǎng)細(xì)胞在 5-10%FBS-DMEM 中能生長(zhǎng)很好。一般來(lái)講,1:10 傳代后,一周可以長(zhǎng)滿(mǎn)嚴(yán)禁過(guò)度生長(zhǎng),這點(diǎn)很重要。因?yàn)闀?huì)導(dǎo)致細(xì)胞密度加大和堆積,影響病毒斑的形成和轉(zhuǎn)染,傳代時(shí)也不易打散

懸浮的293T細(xì)胞很容易大規(guī)模培養(yǎng),但不容易長(zhǎng)期保持穩(wěn)定。293T 細(xì)胞在傳代120次以后,其表型可能改變,生長(zhǎng)狀況不再是單層的了,偶爾會(huì)形成局部的細(xì)胞成團(tuán)聚集,應(yīng)立即拋棄,重新引入新傳代的細(xì)胞

293T細(xì)胞培養(yǎng)特性:

1. 細(xì)胞明顯適應(yīng)酸性環(huán)境pH值在6.9~7.1時(shí)可順利貼壁生長(zhǎng)換液293T時(shí)動(dòng)作要輕。一般用高糖的DMEM培養(yǎng)基

2、傳代: 倒去廢液,PBS 洗一次 (),用0.02%EDTA0.25%Trypsin 消化,生長(zhǎng)良好細(xì)胞培養(yǎng)瓶中輕搖,使之流遍所有細(xì)胞表面,即將其吸除或棄去消化 30s,然后吸去,再讓剩下的EDTA/Trypsin 作用30s鏡下觀察細(xì)胞脫落,就可加DMEM 終止消化,反復(fù)吹打至細(xì)胞全成單個(gè)懸浮細(xì)胞即可。12小時(shí)-24小時(shí) 90%以上細(xì)胞貼壁。293細(xì)胞傳代時(shí)機(jī)為達(dá) 80-90%匯合,傳代比例為1:3

3、293 細(xì)胞在低代時(shí)容易貼壁,生長(zhǎng)良好,在傳到幾十代以后,易聚集成團(tuán),且貼壁不牢,用PBS沖洗時(shí)即可能脫落,即使消化后也不容易吹打成單細(xì)胞懸液,最好購(gòu)入時(shí)先大量?jī)龃?/span>

4、復(fù)蘇:293細(xì)胞的另一生長(zhǎng)特性是貼壁所需時(shí)間長(zhǎng)且貼壁不牢。細(xì)胞冷凍后復(fù)蘇時(shí),都有不同程度的腫脹若以50ml培養(yǎng)瓶待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底的70%~80%時(shí)消化凍存,復(fù)蘇時(shí)將其全部接種至2個(gè)50ml 瓶中時(shí)較為合適。剛復(fù)蘇的 293 貼壁很慢,復(fù)蘇接種后24小時(shí)內(nèi),應(yīng)盡量減少觀察細(xì)胞次數(shù)或不作觀察,以免因晃動(dòng)而影響細(xì)胞貼壁。復(fù)蘇后48 小時(shí)左右觀察貼壁情況并進(jìn)行更換培養(yǎng)基比較合適,如果用一次性塑料培養(yǎng)瓶可增加細(xì)胞貼壁牢度。換液前宜將培養(yǎng)基預(yù)熱

5轉(zhuǎn)染: 體外應(yīng)用293細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí),如果是采用磷酸轉(zhuǎn)染,一定要注意 293 細(xì)胞不要全部長(zhǎng)滿(mǎn)細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán),長(zhǎng)滿(mǎn)細(xì)胞時(shí)加入磷酸鈣就會(huì)使 293 細(xì)胞大片的脫落,最好是當(dāng)293生長(zhǎng)到 1/22/3 時(shí)進(jìn)行磷酸轉(zhuǎn)染,可以避免細(xì)胞的大量脫落

1.Corning® DMEM培養(yǎng)基

2. Corning® CellBIND® 6孔透明多孔板,平底,帶蓋,無(wú)菌  產(chǎn)品編號(hào)3335  5/

3. Corning® CellBIND® 12孔透明多孔板,平底,帶蓋,無(wú)菌   (產(chǎn)品編號(hào)3336  5/

4. Corning® CellBIND® 24孔透明多孔板,平底,帶蓋,無(wú)菌 產(chǎn)品編號(hào)3337  5/包)

5. Corning® Donor Horse Serum, 500 mL, United States Origin  產(chǎn)品編號(hào):35-030-CV

 

 

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