ELISA方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測(cè)定。但ELISA測(cè)定中影響因素較多，而且其操作中有一定的技術(shù)要求，在檢測(cè)過程中除正常反應(yīng)外，有時(shí)常見到一些錯(cuò)誤的結(jié)果。引起ELISA測(cè)定錯(cuò)誤結(jié)果的原因主要有：①標(biāo)本因素；②試劑因素；③操作因素。下面就一些常見ELISA操作過程中的問題一一分析。

 

1．樣品稀釋 

酶聯(lián)免疫反應(yīng)是一種敏感性很高的反應(yīng)，如果血清不稀釋，不可避免會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的非特異性反應(yīng)，出現(xiàn)假陽(yáng)性。因此，國(guó)外檢測(cè)血清抗體的試劑盒，均規(guī)定將血清稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，以降低非特異性反應(yīng)，使特異性的抗原抗體反應(yīng)充分體現(xiàn)出來(lái)。一般產(chǎn)品的樣品稀釋倍數(shù)均通過大量試驗(yàn)確定，以保證試驗(yàn)的靈敏度和特異性。但是，有些用戶未能嚴(yán)格按使用說(shuō)明書操作，如某些產(chǎn)品應(yīng)取10μl樣品進(jìn)行稀釋，個(gè)別用戶取5μl甚至1μl樣品進(jìn)行稀釋，由于吸嘴上不可避免地沾有樣品以及微量移液器的精度不夠，因此造成樣品稀釋倍數(shù)不準(zhǔn)確，檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)問題。

 

2．試劑盒平衡 

試劑盒中所有試劑和板條均應(yīng)在試驗(yàn)前平衡至室溫(約25℃)，一般需在室溫放置20～30分鐘以上。平衡時(shí)間太短會(huì)造成試劑混勻不夠，樣品孵育時(shí)間相對(duì)縮短，ELISA反應(yīng)不夠充分。冬季室溫低，可將試劑盒置37℃溫箱20分鐘。

 

3．樣品和試劑的混勻 

稀釋前、后的樣品必須充分混勻，所有試劑在加樣前也須搖勻，以保證試驗(yàn)的均一性。

 

4．加樣 

在現(xiàn)在的ELISA商品試劑盒中，必然有使用微量加樣器加入樣本的步驟。注意的關(guān)鍵點(diǎn)是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快，無(wú)法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附。濺出會(huì)對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。所以，有時(shí)候一份標(biāo)本用相同的試劑盒這次測(cè)定為陽(yáng)性，下次測(cè)定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯(cuò)誤所致。

 

5．溫育 

溫育是ELISA測(cè)定中影響測(cè)定成敗最為關(guān)鍵的一個(gè)因素。ELISA作為一種固相免疫測(cè)定，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進(jìn)行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原全部結(jié)合，必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時(shí)間。溫育所需時(shí)間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時(shí)間相對(duì)較短。最為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。一些操作者，擅自改變說(shuō)明書操作，使用自己喜歡的溫育時(shí)間和溫育溫度，這樣造成一些不必要的麻煩。因?yàn)椋煌噭┖杏胁煌臏赜龝r(shí)間和溫育溫度的選擇，隨意更改溫育時(shí)間或者溫育溫度將導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差。

 

6．洗板 

固相免疫測(cè)定技術(shù)是一種非均相免疫測(cè)定技術(shù)，需以洗滌操作將特異結(jié)合于固相的抗原或抗體與反應(yīng)溫育過程中吸附的非特異成份分離開來(lái)，以保證ELISA測(cè)定的特異性。洗板對(duì)于ELISA測(cè)定來(lái)說(shuō)，也是極其關(guān)鍵的一步。洗液盡量不要溢出孔外；加洗液后要靜置1分鐘，甩去板孔中洗液后，一定要大力拍干；及時(shí)更換吸水紙，尤其是拍過酶標(biāo)記物的吸水紙一定要棄去，否則可能影響試驗(yàn)結(jié)果。

 

7．邊緣效應(yīng) 

使用96孔板的ELISA測(cè)定中，常發(fā)現(xiàn)有“邊緣效應(yīng)"，即外周孔顯色較中心孔深。經(jīng)研究證實(shí)在溫育中的熱力學(xué)梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身為不良熱導(dǎo)體，在實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)ELISA測(cè)定中，將板從室溫（通常在25℃左右）置于37℃溫箱，板也升溫時(shí)，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學(xué)梯度。因此使用水浴或在將反應(yīng)溶液加入至板孔中時(shí)，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如37℃），就可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)"，并且可提高測(cè)定的重復(fù)性。

 

8．顯色 

顯色一定要控制時(shí)間,根據(jù)試劑盒說(shuō)明操作即可。一般來(lái)說(shuō)，顯色時(shí)間過短，結(jié)果偏低；顯色時(shí)間過長(zhǎng)，空白增高或者非特異性顯色增加。

 

9．比色 

比色要注意波長(zhǎng)的選擇。以TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長(zhǎng)為450nm，后者為492nm，濾光片需根據(jù)要求隨時(shí)更換。因此，容易出現(xiàn)濾光片錯(cuò)用的問題。 

其次，單波長(zhǎng)或雙波長(zhǎng)比色選擇的問題。所謂的單波長(zhǎng)比色即是通常的以對(duì)顯色具有最大吸收的波長(zhǎng)如450nm或492nm進(jìn)行比色測(cè)定；而雙波長(zhǎng)雙色則酶標(biāo)儀在敏感波長(zhǎng)如450nm和非敏感波長(zhǎng)如630nm下各測(cè)定一次，敏感波上下的吸光度測(cè)定值為樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長(zhǎng)下測(cè)定即改變波長(zhǎng)至一定值，使得樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度值為零，此時(shí)測(cè)得的吸光度即為臟物的吸光度值。最后酶標(biāo)儀給出的數(shù)值為敏感波長(zhǎng)下的吸光度值與非常感波長(zhǎng)下的吸光度值的差。因此，雙波長(zhǎng)比色測(cè)定具有能排除由微滴板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對(duì)特異顯色測(cè)定吸光度的影響的優(yōu)點(diǎn)。由于ELISA測(cè)定中單個(gè)空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性，也就是說(shuō)每次測(cè)定或同次測(cè)定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測(cè)定值，故而在ELISA測(cè)定比色時(shí)，最好是使用雙波長(zhǎng)比色。 

 

綜上所述，盡管ELISA測(cè)定的操作步驟非常簡(jiǎn)單，但有可能會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的因素卻較多，分布在測(cè)定操作的各步之中，尤以加樣、溫育和洗板為甚。為幫助大家分析查找測(cè)定中出現(xiàn)問題的可能原因，特對(duì)常見問題及原因歸納總結(jié)于下表。

 

操作過程中可能出現(xiàn)的問題和解決方法

 

問題 可能原因 解決方法

顯色淡，靈敏度偏低 1、試劑盒在運(yùn)輸途中時(shí)間太長(zhǎng)，溫度太高 盡量縮短運(yùn)輸時(shí)間，夏季應(yīng)放冰塊降溫

2、試劑盒未充分平衡 試劑盒從2～8℃冰箱取出后打開盒蓋，于室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫（約25℃）。

3、培養(yǎng)箱溫度不足37℃ 注意培養(yǎng)箱溫度，放入反應(yīng)板后盡量減少開啟次數(shù)以免影響溫度恒定，非隔水式培養(yǎng)箱尤其應(yīng)注意

4、保溫時(shí)間不足 校正定時(shí)鐘準(zhǔn)確定時(shí)

5、洗滌時(shí)沖擊力太大、浸泡時(shí)間過長(zhǎng)、洗滌次數(shù)增加 按說(shuō)明書要求保留洗滌時(shí)間，準(zhǔn)確記住洗滌次數(shù)

6、移液器吸液量不足，吸嘴內(nèi)壁掛水太多或內(nèi)壁不清潔 校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時(shí)要緊密，吸嘴內(nèi)壁要清潔，最好一次性使用

7、蒸餾水水質(zhì)有問題 使用新鮮合格的蒸餾水

8、底物作用時(shí)間不足 準(zhǔn)確定時(shí)

背景深，全部呈有色, 1、洗滌不充分，洗后未拍干，樣品中其它成分殘留或酶標(biāo)記物殘留 濃縮洗液準(zhǔn)確配制；10倍濃縮洗滌液如有結(jié)晶則應(yīng)讓結(jié)晶于室溫全部溶解后再量取稀釋；充分洗滌，全部拍干。加樣或加酶拍板的濾紙應(yīng)棄去不用，不要反復(fù)使用，否則易造成污染

2、樣品污染 樣品應(yīng)新鮮采集，或低溫保存，防止污染

3、培養(yǎng)箱溫度超過37℃或反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng) 調(diào)整培養(yǎng)箱溫度，準(zhǔn)確定時(shí)

4、吸嘴重復(fù)使用，未洗凈或消毒不干凈 吸嘴盡可能一次性使用

5、蒸餾水被污染 使用新鮮蒸餾水

6、酶等試劑混用 不同批號(hào)試劑勿混用

7、一次實(shí)驗(yàn)的標(biāo)本量過多，加樣時(shí)間太長(zhǎng)，導(dǎo)致實(shí)際反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng) 合理安排實(shí)驗(yàn)，避免幾塊酶標(biāo)板同時(shí)加樣

重復(fù)性不佳 1、樣品數(shù)量多少不一，加樣時(shí)間有長(zhǎng)有短 重復(fù)某一樣品時(shí)，加樣時(shí)間盡可能與第一次接近

2、保溫時(shí)間不一致，洗滌條件不一致，操作人員不一致 重復(fù)測(cè)定標(biāo)本，操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性

3、加樣量不一致 樣品稀釋前應(yīng)充分混勻，盡可能使用同一移液器并裝緊吸嘴

出現(xiàn)白板，陽(yáng)性對(duì)照不顯色 顯色液變質(zhì) 更換新的顯色液

洗滌液配制有誤 請(qǐng)按說(shuō)明書所示稀釋倍數(shù)配制

未加酶結(jié)合物而認(rèn)為已加入 注意不要漏加

終止液誤作洗滌液稀釋或當(dāng)?shù)孜镆菏褂?span id="hlxr3ll" class="Apple-tab-span" style="white-space: pre;"> 每次加液前均應(yīng)看清標(biāo)簽